采用表麵張力、界麵張力、熒光、動態光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）等方法，研究了由Bacillus subtilis HSO121所產生的一組表麵活性素的膠束化行為。通過對表麵活性素溶液表麵張力、表麵活性素對水/正己烷界麵張力的影響、表麵活性素膠束微極性以及膠束粒徑和形態的研究，發現隨著表麵活性素脂肪鏈長度的增加，其表界麵活性增強，溶液中趨向於形成更大的聚集體。

1引言

表麵活性素（surfactin）是脂肽家族中一類具有代表性的生物表麵活性劑。脂肽是由微生物在細胞表麵或者由胞外分泌產生的一類由脂肪酸和肽組成的具有兩親結構的化合物，是優良的生物表麵活性劑。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）產生的脂肽主要有表麵活性素（surfactin）、地衣素（lichenysin）、伊枯草素（iturins）和豐原素（fengycin）等。表麵活性素在1968年由Arima等1鑒定命名，其化學結構由Kakinuma等確定為含有7個α-氨基酸和β-羥基脂肪酸構成的環狀脂肽類化合物。表麵活性素可以在1×10-5mol·L-1濃度時，將水的表麵張力由72 mN·m-1降低到27 mN·m-1,是表麵活性最強的一類脂肽。另外表麵活性素還表現出特殊的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗真菌、抗HIV和溶血等。表麵活性素的這些表麵和生物活性與它在水溶液中的物理化學性質有著密切的關係，因此研究表麵活性素溶液的性質以及膠束化過程對於進一步探索表麵活性素的生物物理活性以及拓展其在化學工業和生物醫藥領域的應用有著重要的意義。

表麵活性素的自身結構，脂肪鏈和氨基酸部分的不同，對表麵活性素的物理化學性質和生物活性都會產生一定的影響。Gallet等14用分子模擬的方法研究了脂肪鏈長度為13、14、15的表麵活性素同係物在親水/親油界麵上的不同構型。Razafindralambo等用動態表麵張力法研究了脂肪鏈長為13、14、15的表麵活性素，發現隨著鏈長的增加，動態界麵張力降低得更快。Song等用LB膜技術研究了烴鏈長度對表麵活性素界麵形態的影響。Deleu等計算模擬了表麵活性素和生物膜的作用，Eeman等研究了烴鏈長度為13、14、15的環狀表麵活性素以及烴鏈長為15的直鏈表麵活性素，都發現鏈長的增加大大加強了表麵活性素的表麵活性，同時也影響著表麵活性素和磷脂膜的相互作用。因此係統研究表麵活性素分子結構對其溶液性質的影響，對表麵活性素的化學和生物應用都有一定的指導意義。

目前，對表麵活性素溶液性質的研究已有一些報道，但是基於分離純化技術的限製，大多數研究都是針對表麵活性素同係物及其類似物的混合體係。這樣得到的結果難以準確地表征表麵活性素膠束化過程以及表麵活性素溶液體係的各個參數，而且各個研究結果之間差異較大，結果不穩定。本文由一株枯草芽孢杆菌HSO121出發，發酵培養及分離純化得到了5種主要表麵活性素，通過表麵張力、界麵張力、熒光法、動態光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）對不同結構的表麵活性素溶液膠束化行為比較，得到表麵活性素結構差異對其溶液性質和膠束化行為的影響規律。

2實驗部分

2.1表麵活性素的製備以及分離純化

實驗所用的表麵活性素樣品由本實驗室分離鑒定的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HSO121培養產生。表麵活性素粗提物用常壓反相柱（YMC ODS C18柱，Φ3.0 cm×10 cm,50μm）純化，去除色素。然後再由高效液相色譜（JASCO LC-2000,日本，HIQ sil C18W柱，Φ21.2 mm×250 mm,5μm），采用甲醇、水體係進一步分離，得到各個表麵活性素的組分，如圖1所示。

圖1表麵活性素的分析型高效液相色譜圖

得到的脂肽先由氨基酸自動分析儀獲得脂肽的氨基酸組成，然後用電噴霧四極杆~飛行時間串聯質譜（ESI Q-TOF MS/MS）和氣相色譜/質譜連用（GC/MS）對脂肽結構進行解析。

實驗所用的表麵活性素樣品結構如圖2所示，脂肪酸鏈碳數分別為12、13、14、15、16。

2.2試劑

KCl,分析純，上海淩峰試劑有限公司；正己烷，分析純，上海菲達工程有限公司；使用0.05 mol·L-1,pH為8.5的Tris（Gene-Tech,純度＞99.95%）緩衝溶液；水為二次重蒸水。

2.3實驗方法

2.3.1表麵張力的測定

配置一係列濃度的表麵活性素水溶液，0.05 mol·L-1Tris緩衝液，pH 8.5,25°C,用表/界麵張力儀及動態接觸角分析係統DCA315（Thermo Cahn,美國）測定其表麵張力。

2.3.2界麵張力測定

固定表麵活性素濃度為4×10-5mol·L-1,用旋滴界麵張力儀TX-550A型（芬蘭Kibron）測定了各個不同結構的表麵活性素對於水和正己烷的油水界麵張力的影響。由TX-550A旋滴界麵張力儀測得表麵活性素水溶液中正己烷液滴的長度L（cm）和寬度D（cm），計算得到界麵張力。當L/D≥4時，可根據式（1）計算液液界麵張力：

圖2表麵活性素結構圖

式中γ為界麵張力（mN·m-1），Δρ為兩相密度差（g·cm-3），Z為儀器上顯示的旋轉周期（ms·2π-1），K為常數0.3817.當L/D＜4時，可根據式（2）計算：

式中f為校正參數，由不同的L/D值對應得到。

2.3.3熒光法

表麵活性素溶液的膠束微環境性質由熒光分光光度計F-4500（Hitachi,日本）測定，采用芘（Sigma-Aldrich,99%（w））作為熒光探針。在激發光波長為335 nm時，芘的熒光發射光譜在350-500 nm有5個特征峰，其中第一峰的熒光強度I1在極性溶劑中呈現出較大的增加，第三峰的熒光強度I3在非極性溶劑中較強，其強度隨條件變化不大，因此I1與I3之比值強烈依賴於環境極性。23測定芘在不同結構表麵活性素溶液（4×10-5mol·L-1）的熒光光譜，研究表麵活性素結構對其膠束微環境性質的影響。

2.3.4動態光散射

通過激光粒度儀Nano-ZS（Malvern,英國）測定了不同結構表麵活性素溶液中膠束粒徑的分布，樣品槽溫度恒定在25°C,表麵活性素濃度為4×10-5mol·L-1.

2.3.5冷凍刻蝕電鏡

將樣品滴入樣品杯內並迅速投入液氮（約77 K）中冷凍固定。在液氮環境下，樣品杯轉移到樣品座上，然後送入冷凍蝕刻儀BALZERS BAF-400D（Bal-tec,列支敦士登）的真空腔中（真空腔中的樣品台及冷刀預冷到約100 K）。取出樣品杆，抽真空。等到係統壓力小於1×10-9Pa時，將樣品斷裂。以45°角向樣品斷裂麵噴鍍厚約2 nm的鉑，然後以垂直方向噴鍍1-20 nm的碳層。取出樣品，重蒸水漂洗，用銅網將複型撈起，晾幹後，用透射電子顯微鏡JEM-1400（JEOL,日本）觀察。

圖3不同鏈長表麵活性素溶液的表麵張力圖