海南大學Jingrong Ma課題組為了更好地了解椰子球蛋白（CG）在不同pH下的乳化機製，研究了不同pH（3-11）未加熱和加熱（90℃，30 min）條件下的界麵行為與乳液穩定性（O/W）之間的關係。CG的動態界麵張力在pH為11時最低，其次是pH為9、3、7和5。CG在pH值為5時界麵吸附效果最好，但在pH值為11時界麵出現解吸情況。各組在加熱後吸附量均下降。pH為5時的CG具有最高的擴張彈性模量（Ed），其次是pH為3、7、9和11。加熱CG的Ed趨勢與未加熱樣品一致，但明顯降低。在高頻和振幅擾動下，pH為11處的CG具有較高的膨脹模量(E)。CG表現出更好的界麵行為，有助於提高pH 3時的乳液穩定性。闡明界麵行為與乳化液穩定性的關係對促進CG作為乳化劑的應用具有重要意義。

動態界麵張力測量方法

一、實驗前準備

1.儀器與試劑

儀器：Kibron界麵張力儀（含Wilhelmy板或Du Noüy環、恒溫水浴模塊、自動進樣器）、pH計（精度±0.01）、電子天平（稱量蛋白）、磁力攪拌器、離心機（可選）、移液槍（1-1000μL）、燒杯/樣品池（潔淨無汙染）。

試劑：椰子球蛋白（純度≥90%，建議分子量10-50 kDa）、超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）、緩衝溶液（如PBS緩衝液，pH範圍5.0-9.0，離子強度0.01-0.1 M，避免幹擾蛋白質吸附）、稀鹽酸/氫氧化鈉（調節pH）。

二、操作步驟

步驟1：儀器預熱與校準

開機：連接電源，打開Kibron界麵張力儀主機及軟件（如DeltaFlow或Kibron Control），啟動恒溫水浴模塊（設置目標溫度，通常25±0.1℃，界麵張力受溫度影響顯著）。

校準：

Wilhelmy板法：使用標準液體（如超純水，25℃時γ≈72 mN/m）校準。將潔淨的Wilhelmy板（鉑片，尺寸約10×20 mm，邊緣垂直）安裝到傳感器上，確保板麵無劃痕、無油脂（可用乙醇擦拭後灼燒冷卻）。在軟件中輸入標準液體的表麵張力值，儀器自動校準位移傳感器與力的關係。

Du Noüy環法（若使用）：校準環的周長（需測量環的內外徑，計算平均周長），並用已知表麵張力的液體驗證準確性。

步驟2：椰子球蛋白樣品製備

溶解：稱取一定量椰子球蛋白（如10 mg），加入5-10 mL對應pH的緩衝液（如pH 7.0的PBS），磁力攪拌（300 rpm）或漩渦振蕩15-30 min，至完全溶解（避免劇烈攪拌產生氣泡）。

pH調節：用1 M HCl或NaOH溶液逐滴調節蛋白溶液pH至目標值（如pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），每次調節後靜置2 min，用校準過的pH計測量確認（插入深度≥1 cm，避免界麵幹擾）。

脫氣（可選）：若溶液含溶解氣體（如空氣），可將樣品置於真空幹燥器中10-15 min，減少界麵氣泡（氣泡會導致界麵張力測量值偏高）。

步驟3：界麵張力測量

安裝樣品池：將清潔的樣品池（玻璃或聚四氟乙烯材質，內徑≥50 mm）置於儀器樣品台上，用移液槍注入20-30 mL待測蛋白溶液（液麵高度需覆蓋Wilhelmy板浸入深度，通常≥20 mm）。

安裝Wilhelmy板：手動或自動將Wilhelmy板緩慢浸入樣品池，確保板麵與液麵垂直，且邊緣剛好接觸液麵（軟件提示“板接觸液麵”後停止）。

平衡等待：啟動測量程序，儀器自動記錄界麵張力隨時間的變化。蛋白質需在界麵上吸附達到平衡（通常5-30 min，具體時間需預實驗確定，觀察數據趨於穩定後停止）。

數據采集：平衡後，軟件自動記錄穩定的界麵張力值（γ），每個pH條件重複測量3次（更換新鮮樣品），取平均值。

步驟4：清洗與切換樣品

測量完一個pH樣品後，用去離子水或下一個pH緩衝液衝洗樣品池和Wilhelmy板3次（避免交叉汙染）。

若板麵有殘留蛋白，可用軟毛刷輕刷鉑片（避免刮傷），再用乙醇擦拭後灼燒（僅適用於耐高溫鉑片）。

三、注意事項

1.pH調節的關鍵控製

蛋白質的界麵張力對pH敏感（尤其接近等電點pI時，電荷減少，疏水性增強），需精確調節pH（建議使用微量移液槍逐滴添加，並充分混勻）。

避免pH調節劑過量（如HCl/NaOH濃度過高可能破壞蛋白質構象），推薦使用0.1 M緩衝液儲備液稀釋至目標離子強度（如0.01 M）。

2.蛋白質溶液的穩定性

椰子球蛋白在極端pH（如pH＜5或＞9）可能變性沉澱，需通過預實驗確定其穩定pH範圍（通常接近生理pH 5-7）。若出現沉澱，需離心（10,000×g，10 min）去除，取上清測量（沉澱可能幹擾界麵吸附）。

蛋白質濃度需適宜（建議0.1-1 mg/mL）：濃度過低時界麵吸附量不足，界麵張力偏高；過高可能導致界麵膜過厚，吸附動力學複雜。

3.儀器清潔與汙染防控

Wilhelmy板需保持絕對潔淨（任何油脂或灰塵會導致界麵張力測量值偏差），使用前可用鉻酸洗液浸泡（10%H₂CrO₄）10 min，再用超純水衝洗並幹燥。

樣品池每次使用後需用去離子水衝洗，避免殘留鹽類或蛋白質吸附（尤其高離子強度緩衝液易在池壁結垢）。

4.溫度與界麵穩定

界麵張力隨溫度升高顯著降低（約每℃下降0.1-0.2 mN/m），需使用恒溫水浴嚴格控製溫度（誤差±0.1℃），並在測量時等待樣品與儀器溫度平衡（約5 min）。

避免環境溫度波動（如空調風直吹），可在儀器周圍放置隔熱罩。

5.數據可靠性驗證

每次測量前檢查Wilhelmy板的濕潤性（浸入純水後應能自動吸附，無氣泡附著）。若板麵疏水，可用稀表麵活性劑（如0.01%SDS）浸泡清洗（僅限玻璃板，鉑片禁用）。

預實驗驗證蛋白質在界麵的吸附行為：通過動態界麵張力曲線（γ-t）判斷是否達到平衡（斜率趨近於0），若長時間不穩定（如持續下降），可能是蛋白質未完全溶解或溶液中有雜質。

結果

Kdiff、Kp和Kr的最高值分別為pH值7、3和5。柔性蛋白可以在油水界麵上更快地吸附和重新排列。pH為3時CG靈活的二級結構，使其具有更好的吸附動力學，。pH 5（接近pI 4.3）的CG更弱的靜電斥力，引起了更好的結構重排。加熱後，除pH值為5時CG的Kdiff外，所有樣品的Kdiff、Kp和Kr均有所下降。加熱後的CG具有較低的初始界麵張力和較短的平衡吸附時間（圖1a），它能迅速達到平衡狀態，並且吸附動力學指數較低。此外，加熱後的CG表現出顯著的變性和聚集，殘留的蛋白質分子會產生空間位阻，從而阻礙聚集後的CG到達油水界麵。此外，不溶性CG聚集體對殘留CG分子的吸附產生了屏障。CG在pH為5時，蛋白質形成大量沉澱，溶解度僅為12.05%。可溶性蛋白含量低意味著較弱的靜電排斥力，這使剩餘的蛋白更容易擴散，從而導致最高的Kdiff。與動態界麵張力相比，CG與pH 5T的吸附動力學不受蛋白質濃度的影響。