摘要

精子結合蛋白（BSP）是牛精漿中的主要蛋白質，已知其部分插入精子膜的外小葉，並與其中存在的含膽堿脂質結合。這種插入通過誘導精子早期獲能，對冷凍保存後的精液質量產生負麵影響。BSP蛋白表麵性質的假設通過張力測定法進行了驗證：BSP蛋白具有高度的表麵活性。這表明BSP蛋白不僅通過相互之間的相互作用，而且由於其自身的表麵活性，能夠到達磷脂覆蓋的界麵。BSP蛋白插入精子外小葉的脂質結構域是在類似Langmuir單分子膜的仿生係統上複製的。BSP蛋白的插入可以在含有膽堿脂質的可壓縮流體域中進行。單層膜也被用來研究BSP蛋白與兩種磷脂組裝物的絡合作用：蛋黃低密度脂蛋白（LDL）或雞蛋磷脂脂質體。無論磷脂結構（脂蛋白或脂質體）如何，BSP都不能改變膜的結構。隻有BSP蛋白與磷脂酰膽堿的總比例是重要的。這兩種螯合劑的區別在於它們的表麵性質：LDL有很強的與外層結合的傾向，而脂質體主要以相同的時間尺度保持在本體中。

1、介紹

精子結合蛋白（BSP）是一個已知在輸卵管精子儲存庫的形成和精子獲能中起作用的蛋白質家族，精子成熟是受精的關鍵步驟[1,2]。在牛精漿中，根據Manjunath等人的命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分別鑒定和分類了三種比例為10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表觀質量為15–16.5 kDa，BSP5的表觀質量為28–30 kDa[6,8]。這三種蛋白質由一個獨特的N端結構域和兩個纖維連接蛋白II型結構域組成。隻有三種BSP蛋白的N端結構域存在顯著差異[4–6]。每個纖維連接蛋白II型結構域包含一個磷酰膽堿結合位點[9–14]。最後這些是BSP蛋白的生物學作用所必需的。事實上，精子膜的外小葉在射精過程中與含有BSP蛋白的精漿接觸[2,15]。BSP蛋白與精子膜上的含膽堿磷脂（如磷脂酰膽堿和鞘磷脂）快速結合[9,12,16–19]，並通過部分插入精子質膜的外小葉[1,13,20]覆蓋精子表麵。這是通向輸卵管精子儲存庫和精子獲能的第一個關鍵步驟。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事實證明BSP蛋白具有兩親性。因此，本研究的第一部分旨在通過進行張力測量來檢驗這一假設。

BSP蛋白誘導的早期獲能[21,22]對冷凍保存後的精液質量有負麵影響，因為它會導致抗冷性和抗凍性的喪失[12,17,23–25]。因此，保護器的存在對維持精子質量至關重要。蛋黃被廣泛用於分離BSP蛋白[17,26–32]。這種隔離是由於蛋黃中存在的低密度脂蛋白（LDL）外層的磷脂酰膽堿與BSP蛋白之間的特異性和強相互作用[9,12,33,34]。在某些情況下，還假設低密度脂蛋白對精子早期獲能的保護作用是由於富含磷脂的低密度脂蛋白極性脂質與由於外排而減少的脂質和膽固醇的精子膜之間的交換[29]。目前，大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黃磷脂的替代品。然而，在這種情況下，脂質體和膜之間可能的相互作用尚不清楚。因此，本研究的第二部分旨在比較低密度脂蛋白和脂質體與脂膜接觸的行為。為此，在空氣-緩衝液界麵上的脂質單層被用來模擬精子膜外小葉的脂質結構域。這種方法被證明能有效地複製牛精子膜外小葉脂質結構域的異質結構域[35]。最後一種是主要的脂質成分，即鞘磷脂、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC）和血漿鹵素1-（1Z-十八烯基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（P-PC）。在這一單層中，膽固醇和鞘磷脂在34°C處由PC和P-PC的液體混合物包圍，形成凝聚結構域◦C.LDL和脂質體在接近生物膜相關壓力的情況下被引入單層下方的亞相[36]。通過監測表麵積的變化來檢測添加劑與單層膜之間的相互作用。最後，在相同的精子膜外小葉脂質模型和相同的條件下，比較了LDL和脂質體對BSP蛋白的隔離特性。

2、材料和方法

2.1.材料

主要構成重構膜外小葉的脂質購自Avanti Polar Lipides（美國阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市），並按接收時使用。化合物1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，純度>99%）和1-（1Z-十八烷基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，純度>99%）作為氯仿溶液（10mg-mL）獲得−1).將PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的儲備溶液稀釋至1.25 mg mL−1解決方案。以綿羊毛膽固醇（Chol，Mw=711.0，純度>98%）和雞蛋鞘磷脂（SM，Mw=386.7，純度>98%）為粉末。二者均以1.25 mg/mL的濃度溶解於氯仿（HPLC級，法國瓦爾德魯伊爾Carlo Erba）−1.

低溫保護培養基由Trizma堿（173.0 mM）、一水合檸檬酸（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素（青黴素G鈉391 mg L）組成−1，硫酸鏈黴素856 mg L−1，鹽酸林可黴素204 mg L−1，硫酸大觀黴素四水合物585 mg L−1）（西格瑪-奧爾德裏奇，法國聖昆廷法拉維爾）。將pH值調整為6.2，其滲透壓約為1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據Moussa等人的方案，從蛋黃中提取低密度脂蛋白（LDL）[31]。提取後，將低密度脂蛋白濃縮提取物（22±0.5 g，相當於8.36 g幹低密度脂蛋白）在低溫保護介質（100 mL）中稀釋。通過micro BCA蛋白質分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，France）對LDL樣品中的蛋白質進行定量，得出8.9±1.0 mg-mL−1.LDL樣品中PC磷脂的含量是根據雞蛋中PC的自然比例（18.4 g PC/100 g幹LDL）計算得出的，Givenbyonton等人[33]。它等於15.4克升−1份低密度脂蛋白樣品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一頭Prim Holstein公牛身上收集牛精子，並立即以10000×g離心兩次，以回收上清液中的精漿。粉色视频网站樣品的蛋白質含量為88.5±5.0mg-mL−1，由micro BCA蛋白質分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，法國）測定。

2.4.脂質體的製備

脂質體由冷凍保護緩衝液中的卵磷脂提取物通過使用Avanti Polar Lipides（美國阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州）的微型擠出機擠出而製備。卵磷脂提取物由磷脂酰膽堿（73%）和磷脂酰乙醇胺（11%）以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分組成。提取物在低溫保護緩衝液中水合過夜，脂質濃度分別為3.90 mg-mL−1（C1），7.28毫克/毫升−1（C2），14.56毫克/毫升−1（C3）和21.84毫克/毫升−1（C4）。然後在超聲波浴中對分散液進行15分鍾的超聲波處理（Elmasonic S 30H，來自德國Singen Elma，功率為275W）。最後，在擠出機中擠出分散體（20次穿過100 nm的膜）。分布尺寸集中在120nm，Zeta電位值為−6毫伏。在BSP存在下引入的脂質體量以重量表示（脂質體分散體C1、C2、C3和C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂質）。不確定度為0.01 mg。

2.5.電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在還原條件下進行。將精漿溶解在pH值為6.8的緩衝液中，該緩衝液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍0.4%組成，以獲得1mg mL−1解決方案。添加9%巰基乙醇v/v，並旋轉樣品，隨後在95℃下加熱◦C 5分鍾。然後，將10?L低範圍分子量標準品（法國Souffelweyersheim Euromedex公司的試劑盒O6U-0511）和10至25?L精漿裝入15%聚丙烯酰胺凝膠（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）中，並與由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩衝液耦合。在20 mA時進行電泳，並用考馬斯藍溶液G250對凝膠進行染色。最後對染色凝膠進行掃描，並使用Multi-Gauge軟件（2.0版，日本富士照片膠片有限公司）評估峰值強度。

2.6.表麵活性測量

吉布斯膜（由精漿溶液擴散到空氣-緩衝界麵形成）的表麵張力在安裝在朗繆爾天平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬蘭）上的15孔板（帶特氟隆邊緣的鋁底多孔板）上測量，該天平配有高靈敏度傳感器（使用合金絲的Wilhelmy方法）。該裝置被放置在一個溫度控製區，固定在23°C◦C，並用純蒸餾水（美國密理博公司Milli-Q係統）校準。測量精度為0.1 mN/m。將精漿放入第一個孔中，然後在下一個孔中用因子2稀釋，依此類推（每個孔的體積為300?L）。每種精漿提取物重複測量4次（n=2）。結果表示為所有測量的平均值。

蛋白質膜的壓縮等溫線是在之前配備傳感器的朗繆爾槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）上測量的。精漿首先在冷凍保存緩衝液（1/100）中稀釋，並在緩衝液表麵逐滴（50?L）擴散。平衡20分鍾後，在室溫下（23℃）記錄壓縮等溫線◦C）。

2.7.精子膜外小葉脂質結構域的重建

精子膜外小葉的脂質結構域如前所述重建[35]。朗格繆爾槽（302LL，NIMA技術，英國）被插入一個自製的手套箱上，放置在抗振動台上，用氬氣衝洗，以避免脂質氧化。表麵壓力的測量精度為0.1 mN/m，使用濾紙製成的一塊極板（英國肯特郡邁德斯通惠特曼國際有限公司生產的無灰惠特曼色譜紙）與電子天平相連。環境溫度固定在20℃◦C.將所有燒瓶和注射器放入手套箱中，然後在攤鋪單層之前用氬氣將手套箱脫氣1小時。朗繆爾天平的溫度由設置為40℃的循環水係統進行恒溫控製◦C.緩衝液表麵的實際溫度為34℃◦C.亞相由低溫保護介質組成。以適當的摩爾比（31:14:16:39）將膽固醇、鞘磷脂、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的氯仿溶液用25?L微型注射器（精確到0.5?L）逐滴地分散到緩衝液亞相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單層保持平衡10分鍾，然後以40 cm2/min的屏障速度開始壓縮。一旦達到目標壓力（25 mN/m），通過調整可移動屏障的表麵積保持壓力恒定。由於單分子層在30 mN/m時不夠穩定，這是與雙層中脂質堆積密度相關的膜壓力[36]，粉色视频网站將目標壓力降低到25 mN/m，其中單分子層更穩定（見結果）。

一旦達到目標壓力（25 mN/m），將其保持1000 s，然後使用彎曲針管將生物分子（LDL、BSP或脂質體）溶液引入亞相。針頭彎曲遠離針尖，並位於槽的底部，以便在壓縮的亞相下方進行注射。之前將當量體積（每種添加劑0.3 mL）移到屏障後麵。注射生物分子後，監測每個脂質分子的麵積變化，並表示為相對於初始值的變化（a/a=（a−A（t0）×100/A（t0）。它已經被跟蹤了3000秒，相當於冷凍保存前處理精液的時間。在這種恒壓模式下，生物分子插入脂質單層導致膜壓力增加，而膜壓力通過增加表麵積而降低。相反，如果生物分子導致脂質單層溶解在亞相中，表麵積就會減小。重複所有數據，偏差不超過表麵積的5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使用低溫插入式低溫固定裝置（美國加坦）製備用於低溫TEM觀察的試樣，其中一滴水懸浮液沉積在輝光放電多孔型碳塗層格柵（美國Ted Pella公司）上。然後，通過將含有試樣的液滴吸幹到支撐碳膜孔上殘留的薄層液體上，製備TEM網格。通過將格柵快速插入液氮冷卻的液態乙烷中，使液膜玻璃化。玻璃化標本安裝在Gatan 910標本架（美國Gatan）中，使用CT-3500-cryotransfer係統（美國Gatan）將其插入顯微鏡中，並用液氮冷卻。然後從保存在玻璃質冰中並懸浮在支撐碳基質上的孔中的標本獲得TEM圖像。

在低劑量條件下觀察樣品（<10 e−/A2），在−178◦C、使用JEM 1230“Cryo”顯微鏡（日本Jeol），在80 kV電壓下運行，並配備LaB6燈絲。所有顯微照片均記錄在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機上。為確保觀察的良好重複性，從幾個樣品製備中采集了一係列超過50張的圖像，放大率不同。